Vergleich der Bioverfügbarkeit von Zink aus drei unterschiedlichen Präparaten in vitro.
angefertigt durch die BIOTESYS GmbH (2007-August)
Im Rahmen dieses Projekts wurde die Bioverfügbarkeit von Zink aus drei unterschiedlichen Präparaten in Darmzellen (CaCo-2) in vitro untersucht.
Einführung
Zum Vergleich der Aufnahme von Zink aus den drei unterschiedlichen Präparaten wurde angenommen, dass
alle Präparatformen nach der oralen Aufnahme und der Passage des Magens in flüssiger Suspension
vorliegen. Die Aufnahme von Zink aus der Nahrung erfolgt im Dünndarm. Für in vitro Versuche geeignete
Modelle auf Basis von Dünndarmzellen existieren nicht, daher wurde auf Zellen zurückgegriffen, welche als
die im Moment beste Darmmodelzelllinie gelten – CaCo-2. Diese Zellen wurden auf Zellkulturinserts kultiviert.
Es war dadurch möglich, ein polares Epithelmodell zu simulieren. Auf einer Seite der Zellschicht erfolgte die
Versorgung mit Nährmedium, während auf der anderen Seite die Testpräparate appliziert wurden. Die
Aufnahme von Zink in die Zellen war dabei das Testkriterium. Um die Vergleichbarkeit zwischen den
unterschiedlichen Formulierungen zu gewährleisten, wurden die Präparate so verdünnt, dass allen
„Darmmodellen“ dieselbe Zinkkonzentration dargeboten wurde. Vor Beginn dieser Aufnahmeuntersuchungen
wurde in Zytotoxassays geprüft, welche maximale Konzentration der Präparate die Zellen nicht schädigt.
Testmaterial
Zink-Reu-Rella® Tabletten – Haltbarkeit 12.6.2008; Charge 9516 (C/No.1-10)
Unizink Tabletten Tabletten – Haltbarkeit 10.2010; Charge 05325
Curazink Kapseln – Haltbarkeit 06.2009; Charge 5363
Prüfung Zinkaufnahme in CaCo-2 Zellen. Mittelwerte der beiden unabhängigen Durchgänge + SEM. Jeder Balken repräsentiert vier Messwerte. Supplementiert wurden 1. 167,75 ng Zink / mL bzw. 2. 83,75 ng Zink / mL.
Die Verdünnungsreihe ergab, dass Kulturen, welche mit Curazink in der Verdünnung 1:2 inkubiert wurden, absterben. Auch die Verdünnung 1:10 des Präparats Curazink führte noch zu einem Rückgang der lebenden Zellen auf ca. 20% der Kontrollkultur. Kulturen, welche mit Suspensionen der Zink-Reu-Rella® Tablette in der Verdünnung 1:2 bzw. 1:10 behandelt wurden, zeigen einen Rückgang der viablen Zellen auf 70-75% der Kontrolle. Alle anderen Kulturen zeigen keinen nennenswerten Rückgang der Viabilitäten. Auf Grund dieser Ergebnisse und unter Berücksichtigung der Zink-Gehalte der drei Präparate wurde die Verdünnung 1:100 von Zink-Reu-Rella® als Maßstab für die Supplementierung gewählt, die Verdünnungen der drei Präparate wurden jeweils auf 167,75 ng Zink / mL Supplementierungslösung eingestellt.
Aufnahme von Zink aus den eingestellten Verdünnungen
Die, wie oben dargestellt, kultivierten Modelle wurden nach 14-tägiger Kultur in den Aufnahmekinetiken
eingesetzt. Es wurden zwei unabhängige Durchgänge mit je zwei gleichbehandelten Replikaten pro Durchgang
durchgeführt. Darüber hinaus wurden zwei Verdünnungen der Präparatsuspensionen eingesetzt
(1. 167,75 ng / mL und 2. 83,875 ng / mL).
1. Supplementierung mit 167,75 ng Zink / mL:
Die Ergebnisse zeigen einen leicht erhöhten Gehalt der Zellen an Zink nach Supplementierung mit der
Zink-Reu-Rella®-Suspension. Die Supplementierung mit Suspensionen aus Unizink oder Curazink zeigte
keinen erhöhten Zinkgehalt. Kulturen welche nur mit Medium (Kontrolle) supplementiert wurden, enthalten
ebenfalls Zink, jedoch etwas weniger als Kulturen, welche mit Zink-Reu-Rella® supplementiert wurden. Mit
Unizink supplementierte Kulturen weisen den gleichen Zinkgehalt auf wie die nur mit Medium behandelten.
Hier wurde also kein zusätzliches Zink aufgenommen. Auffallend ist der reduzierte Gehalt nach Behandlung
mit Curazink. Dies könnte auf einen Auswascheffekt des Präparates zurückzuführen sein.
Die Unterschiede zw. den Zinkgehalten der Gruppen sind bis auf die Gruppen Zink-Reu-Rella® und Curazink
nicht siginifikant (p= < 0,05).
2. Supplementierung mit 83,875 ng Zink / mL:
Nach der Supplementierung mit der höheren Verdünnung der Testpräparate (halbierte Konzentration gegenüber
der 1. Supplementierung) konnte keine Zinkaufnahme festgestellt werden. Die Zinkgehalte der Kulturen
bleiben auf dem Niveau der Kontrollkulturen. Auch der Auswascheffekt bei Curazink ist nicht mehr zu
beobachten, dies ist wahrscheinlich auf die weitere Verdünnung der Begleitstoffe im Präparat zurückzuführen.
Die Rezeptur des Mediums weist kein Zink auf, daher kommt als einzige Quelle das foetale Rinderserum in
Frage, welches dem Medium zugesetzt werden muss. Der Gehalt des Serums an Zink ist nicht bekannt,
jedoch wurden alle Verdünnungen der Zinkpräparate mit demselben Medium und damit mit dem selben
Serumanteil erstellt. Es ist also davon auszugehen, dass alle Kulturen über das Medium dieselbe Menge an
Zink angeboten bekamen. Über die Präparate wurde zusätzliches Zink jedoch in allen Fällen in der gleichen
Menge angeboten. Der Unterschied zw. den Supplementierungsgruppen besteht also nur in den Inhaltsstoffen
der Präparate. Durch diesen Ansatz wird gewährleistet, dass sich der Vergleich nur auf die Formulierungen
bezieht.
Die Vermessung der Waschpuffer, die vor der Ernte der Zellen gewonnen wurden, ergab Messwerte unterhalb
der Bestimmungsgrenze der Analyse (< 10 ng/ mL). Damit ist der Nachweis erbracht, dass die Messwerte der
Zellpellets auf intrazellulärem Zink beruhen und nicht auf an der Zelloberfläche haftenden Präparats.
Fazit
Unter den beschriebenen Versuchsanordnungen zeigt als einziges der Präparate Zink-Reu-Rella® einen, über
die Kontrolle hinausgehenden Zinkgehalt und daher die beste Aufnahmeeffektivität.